تولید متالوپروتئیناز 63 کیلو دالتونی (gp63) لیشمانیا ماژور در مخمر متیلوتروف Pichia pastoris

سابقه و هدف: با توجه به مشکلات ناشی از لیشمانیا به عنوان یک انگل داخل سلولی بیماریزا که بیش از 12 میلیون نفر را در بیش از 86 کشور جهان مبتلا نموده است و در راستای ارزیابی توانایی گلیکوپروتئین 63 کیلودالتونی (gp63) لیشمانیا ماژور به عنوان یک ایمنوژن در تحریک سیستم ایمنی میزبان و همچنین آنتی ژن تشخیصی، ژن کد کننده مولکول فوق در وکتور دو میزبانه pHIL-S1 به منظور بیان آن ژن در مخمر متیلوتروف P.pastoris کلون و بیان گردید و در نهایت خصوصیات مولکول نوترکیب حاصل نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. مواد و روش ها: ژن تغییر یافته gp63 به گونه ای که فقط پروتئین بالغ راکد نماید، در وکتور دو میزبانه (و همچنین پلاسمید puc19) کلون گردید. مخمر Pichia pastoris (سویه های KM71 و GS115) با پلاسمید دو میزبانه نوترکیب و همچنین با پلاسمید pHIL-s1 (به تنهایی) ترانسفورم گردید. کلون های ترانسفورم شده در محیط فاقد هیستیدین انتخاب شدند، DNA کروموزومی ترانسفورمنت ها تخلیص گردید و با روش های PCR و S.B) Southern Blotting)، وارد شدن ژن فوق در کروموزوم مخمر نوترکیب مورد ارزیابی قرار گرفت. ترانسفورمنت های تایید شده، در محیط حاوی گلیسرول BMGY، تا حصول کدورت OD600=6 کشت و سپس جهت بیان ژن هترولوگ فوق به محیط حاوی متانول، BMMY، انتقال داده شدند. با افزودن متانول به صورت روزانه، حالت القا در آنان حفظ گردید. با تخلیص RAN و انجام N.B) Northern Blotting) صحت نسخه برداری و همچنین بیان ژن فوق (تولید پروتئین نوترکیب) با ژل 12% SDS-PAGE، وسترن بلاتینگ و IFA مورد ارزیابی قرار گرفت. میکروسکوپ الکترونی و ایمونوالکترون میکروسکپی برای تعیین محل داخل سلولی گلیکوپروتئین هترولوگ rgp63، در مخمر بیان کننده ژن فوق مورد استفاده قرار گرفتند. فعالیت متالوپروتئیناز نوترکیب (rgp63) و همچنین تاثیر بازدارنده های آنزیمی با SDS-PAGE gelatin مطالعه گردید، توانایی مخمر در گلیکوزیلاسیون متالوپروتئیناز نوترکیب (rgp63) نیز سنجش گردید. یافته ها: PCR و (S.B) وارد شدن ژن gp63 را به گونه ای صحیح در کروموزوم مخمر نوترکیب تائید کردند. (N.B) بر روی RNA تخلیص شده از مخمر نوترکیب صحت نسخه برداری از ژن gp63، ژل 12% SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ نیز، بیان ژن فوق (تولید پروتئین نوترکیب) را در مخمر ترانسفورمنت تائید نمودند. مطالعه با SDS-PAGE gelatin gel، فعال بودن مولکول فوق را اثبات نمود. یدواستامید و EDTA با غلظت 5 میلی مولار از فعالیت این مولکول در ژل مزبور ممانعت نمودند. بررسی ها با میکروسکوپ الکترونی وجود ناحیه پروتئینی متراکم را در فضای پریپلاسمی مخمر ترانسفورم شده با پلاسمید حاوی ژن نشان داد. بررسی های ایمونوالکترون میکروسکوپی و IFA نیز تایید نمودند که ناحیه پروتئینی فوق، همان پروتئین نوترکیب (rgp63) می باشد. آزمون PNGase-F نیز گلیکوزیله بودن باندهای بیش از 53 کیلودالتونی آن را اثبات نمود. نتیجه گیری: گلیکوپروتئین 63 کیلودالتونی تولید شده در مخمر به فرم طبیعی خود بیشتر شباهت دارد، زیرا علاوه بر گلیکوزیله بودن در SDS-PAGE gelatin gel نیز فعال می باشد